Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir genin çoklu kopyalarını yapmak için moleküler bir genetik tekniktir ve aynı zamanda gen dizileme sürecinin bir parçasıdır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nasıl Çalışır?
Gen kopyaları bir DNA örneği kullanılarak yapılır ve teknoloji, örnekte bulunan genin tek bir kopyasından birden fazla kopya yapmak için yeterince iyidir. Milyonlarca kopya yapmak için bir genin PCR amplifikasyonu, DNA parçasının boyutuna ve yüküne (+ veya -) dayalı görsel teknikler kullanılarak gen dizilerinin saptanmasına ve tanımlanmasına olanak tanır.
Kontrollü koşullar altında, DNA polimerazları olarak bilinen ve tamamlayıcı deoksinükleotitler ekleyen enzimler tarafından küçük DNA parçaları üretilir. (dNTP'ler) "şablon" olarak bilinen bir DNA parçasına aktarılır. Başlangıç noktası olarak "primerler" adı verilen daha küçük DNA parçaları bile kullanılır. polimeraz.
Primerler, genellikle 15 ila 30 nükleotid uzunluğunda, insan yapımı küçük DNA parçalarıdır (oligomerler). Amplifiye edilen genin en uçlarındaki kısa DNA dizilerini bilerek veya tahmin ederek yapılırlar. PCR sırasında, dizilenen DNA ısıtılır ve çift iplikler ayrılır. Soğuduktan sonra, primerler şablona bağlanır (tavlama olarak adlandırılır) ve polimerazın başlaması için bir yer oluşturur.
PCR Tekniği
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), termofillerin ve termofiliklerin keşfiyle mümkün olmuştur. polimeraz enzimleri (yüksek sıcaklıkta ısıtıldıktan sonra yapısal bütünlüğü ve işlevselliği koruyan enzimler) sıcaklıklar). PCR tekniğinde yer alan adımlar aşağıdaki gibidir:
- DNA şablonu, polimeraz enzimi, primerler ve dNTP'lerin optimize edilmiş konsantrasyonları ile bir karışım oluşturulur. Isıtma yeteneği enzimi denatüre etmeden karışım, DNA örneğinin çift sarmalının 94 derece aralığındaki sıcaklıklarda denatüre edilmesini sağlar. Santigrat.
- Denatürasyonun ardından numune, primerlerin tek iplikli DNA şablonlarına bağlanmasını (bağlanmasını) kolaylaştıran yaklaşık 54 derece daha ılımlı bir aralığa soğutulur.
- Döngünün üçüncü adımında, numune uzama için Taq DNA Polimeraz için ideal sıcaklık olan 72 dereceye yeniden ısıtılır. Uzama sırasında, DNA polimeraz, tamamlayıcı dNTP'leri eklemek için orijinal tek DNA zincirini şablon olarak kullanır. her bir primerin 3' uçlarına ve ilgili gen bölgesinde çift sarmallı DNA'nın bir bölümünü oluşturur.
- Tam eşleşmeyen DNA dizilerine tavlanmış olan primerler 72 derecede tavlanmış halde kalmaz, dolayısıyla ilgili genle uzamayı sınırlar.
Bu denatüre etme, tavlama ve uzatma işlemi birden fazla (30-40) kez tekrarlanır, böylece karışımdaki istenen genin kopya sayısı katlanarak artar. Bu işlem manuel olarak yapıldığında oldukça zahmetli olsa da, numuneler hazırlanıp inkübe edilebilir. Programlanabilir Thermocycler, artık çoğu moleküler laboratuvarda yaygın olarak bulunur ve tam bir PCR reaksiyonu 3-4 saat.
Her denatüre etme adımı, önceki döngünün uzama sürecini durdurur, böylece yeni DNA zincirini keser ve onu yaklaşık olarak istenen genin boyutunda tutar. Uzama döngüsünün süresi, ilgilenilen genin boyutuna bağlı olarak daha uzun veya daha kısa yapılabilir, ancak nihayetinde tekrarlanan döngüler yoluyla. PCR, şablonların çoğu, her ikisinin ürünlerinden üretilmiş olacağından, yalnızca ilgilenilen genin boyutuyla sınırlı olacaktır. primerler.
birkaç farklı var başarılı PCR için faktörler sonuçları geliştirmek için manipüle edilebilir. PCR ürününün varlığını test etmek için en yaygın kullanılan yöntem, agaroz jel elektroforezi. Boyut ve yüke göre DNA parçalarını ayırmak için kullanılır. Parçalar daha sonra boyalar veya radyoizotoplar kullanılarak görselleştirilir.
Evrim
PCR'nin keşfinden bu yana, orijinal Taq dışındaki DNA polimerazları keşfedilmiştir. Bunlardan bazıları daha iyi "düzeltme okuma" yeteneğine sahiptir veya daha yüksek sıcaklıklarda daha kararlıdır, böylece PCR'nin özgüllüğünü iyileştirir ve yanlış dNTP'nin eklenmesinden kaynaklanan hataları azaltır.
PCR'nin bazı varyasyonları belirli uygulamalar için tasarlanmıştır ve artık moleküler genetik laboratuvarlarında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları Real-Time PCR ve Reverse-Transkriptaz PCR'dir. PCR'nin keşfi aynı zamanda DNA dizilemenin gelişmesine de yol açmıştır. DNA parmak izi ve diğer moleküler teknikler.