Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yoluyla DNA Amplifikasyonu

PCR anlamına gelir polimeraz zincirleme reaksiyonukontrollü koşullar altında DNA polimeraz enzimleri kullanılarak çoklu kopyalar üreterek DNA segmentlerini büyütmek için bir moleküler biyoloji tekniğidir. Bir DNA segmentinin veya geninin tek bir kopyası, boyalar ve diğer görüntüleme teknikleri kullanılarak tespit edilmesine izin vererek milyonlarca kopyaya klonlanabilir.

1983 yılında geliştirilen PCR işlemi, DNA dizilimi ve münferit genlerdeki nükleotitlerin sırasını belirlemek. Yöntem, termal döngü veya DNA eritme ve replikasyon için reaksiyonun tekrar tekrar ısıtılması ve soğutulmasını kullanır. PCR devam ettikçe, “yeni” DNA, replikasyon için bir şablon olarak kullanılır ve DNA şablonunu katlanarak büyüten bir zincirleme reaksiyon oluşur.

PCR teknikleri biyoteknolojinin birçok alanında uygulanır. protein mühendisliği, klonlama, adli tıp (DNA parmak izi), babalık testi, kalıtsal ve / veya bulaşıcı hastalıkların teşhisi ve analiz çevre örnekleri.

Özellikle adli tıpta PCR özellikle yararlıdır çünkü en küçük miktarda DNA kanıtı bile çoğaltır. PCR, binlerce yıllık DNA'yı analiz etmek için de kullanılabilir ve bu teknikler, 800.000 yaşındaki mamuttan dünyanın dört bir yanındaki mumyalara kadar her şeyi tanımlamak için kullanılmıştır.

Bu adım sadece sıcak başlatma PCR gerektiren DNA polimerazlar için gereklidir. Reaksiyon 94 ile 96 ° C arasında ısıtılır ve 1-9 dakika tutulur.

Prosedür başlatmayı gerektirmiyorsa, denatürasyon ilk adımdır. Reaksiyon, 20-30 saniye boyunca 94-98 ° C'ye kadar ısıtılır. DNA şablonunun hidrojen bağları bozulur ve tek iplikçikli DNA molekülleri oluşturulur.

Reaksiyon sıcaklığı 50 ila 65 ° C arasında daha düşüktür ve 20-40 saniye tutulur. Primerler tek sarmallı DNA şablonuna tavlanır. Bu aşamada sıcaklık son derece önemlidir. Çok sıcaksa, astar yapışmayabilir. Çok soğuksa, astar kusursuz bir şekilde yapışabilir. Primer sekansı, şablon sekansı ile yakından eşleştiğinde iyi bir bağ oluşur.

Bu aşamadaki sıcaklık, polimerazın tipine bağlı olarak değişir. DNA polimeraz tamamen yeni bir DNA zincirini sentezler.

Bu adım, son PCR çevriminden sonra 5-15 dakika boyunca 70-74 ° C'de gerçekleştirilir.

Bu adım isteğe bağlıdır. Sıcaklık 4-15 ° C'de tutulur ve reaksiyonu engeller.

Her döngü sırasında, ürün (çoğaltılan spesifik DNA parçası) iki katına çıkar.

DNA polimeraz aktivitesini kaybettiğinde ve reaktifleri tükettiğinde reaksiyon yavaşlar.

Artık ürün birikmez.