Mikrobiyolojide Gram Leke Prosedürü

Gram boya, atamada kullanılan farklı bir boyama yöntemidir. bakteriler özelliklerine göre iki gruptan birine (gram-pozitif ve gram-negatif) hücre duvarları. Gram boyama veya Gram yöntemi olarak da bilinir. Prosedür tekniği geliştiren kişi, Danimarka bakteriyolog Hans Christian Gram için adlandırılmıştır.

Prosedür, bazı bakterilerin hücre duvarlarındaki peptidoglikan arasındaki reaksiyona dayanır. Gram boyası bakterilerin boyanmasını, rengin bir mordant ile sabitlenmesini, hücrelerin renginin ayrılmasını ve bir karşı boya uygulanmasını içerir.

1. Birincil leke (kristal Menekşe) peptidoglikana bağlanır, mor renk hücreleri. Hem gram-pozitif hem de gram-negatif hücrelerin hücre duvarlarında peptidoglikan vardır, bu nedenle başlangıçta tüm bakteriler menekşe leke bırakır.
2. Gram iyotu (iyot ve potasyum iyodür) bir mordan veya fiksatif olarak uygulanır. Gram-pozitif hücreler bir kristal menekşe-iyot kompleksi oluşturur.
3. Alkol veya aseton, hücreleri renklendirmek için kullanılır. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarlarında çok daha az peptidoglikan vardır, bu nedenle bu adım onları renksiz hale getirir, ancak rengin sadece bir kısmı daha fazla peptidoglikan (hücre duvarının% 60-90'ı) olan gram-pozitif hücrelerden çıkarılır. Gram-pozitif hücrelerin kalın hücre duvarı, renk giderici adım ile dehidre edilir, bu da büzülmelerine ve içerideki leke-iyot kompleksini hapsetmelerine neden olur.
   instagram viewer
4. Renk giderici adımdan sonra, bakterileri pembe renklendirmek için bir karşı boya uygulanır (genellikle safranin, ancak bazen fuchsine). Hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakteriler pembe lekeyi alır, ancak gram-pozitif bakterilerin koyu morları üzerinde görünmez. Boyama prosedürü doğru şekilde yapılırsa, gram-pozitif bakteriler mor, gram-negatif bakteriler pembe olacaktır.

Gram boyasının sonuçları izlendi ışık mikroskobu kullanarak. Bakteriler renklendirildiğinden, sadece Gram leke grubu değil, aynı zamanda onların şekli, boyut ve topaklanma modeli gözlenebilir. Bu, Gram boyasını tıbbi bir klinik veya laboratuvar için değerli bir teşhis aracı yapar. Leke bakterileri kesin olarak tanımlayamasa da, genellikle gram pozitif veya gram negatif olduklarını bilmek etkili bir antibiyotik reçete etmek için yeterlidir.

Bazı bakteriler gram değişken veya gram belirsiz olabilir. Bununla birlikte, bu bilgiler bile bakteriyel kimliğin daraltılmasında yararlı olabilir. Teknik, kültürler 24 saatten daha eski olduğunda daha güvenilirdir. Et suyu kültürlerinde kullanılabilse de, önce onları santrifüjlemek en iyisidir. Tekniğin birincil sınırlaması, teknikte hatalar yapılması durumunda hatalı sonuçlar vermesidir. Güvenilir bir sonuç elde etmek için uygulama ve beceri gereklidir. Ayrıca, enfeksiyöz bir ajan bakteriyel olmayabilir. Ökaryotik patojenler gram negatif boyar. Ancak, çoğu ökaryotik hücreler mantarlar hariç (maya dahil) işlem sırasında slayda yapışmaz.

• Kristal viyole (birincil leke)
• Gram iyotu (mordan, hücre duvarındaki kristal menekşeyi düzeltmek için)
• Etanol veya Aseton (renk giderici)
• Safranin (ikincil leke veya ters boyama)
• Bir fışkırmak şişe veya damlalık şişe su
• Mikroskop lamları
• Bileşik mikroskop

1. Bir slayt üzerinde küçük bir damla bakteri örneği yerleştirin. Bunsen brülörünün alevinden üç kez geçirerek bakterileri slayda ısıtın. Çok fazla ısı veya çok uzun süre uygulanması bakteri hücre duvarlarını eritebilir, şeklini bozabilir ve yanlış bir sonuca yol açabilir. Çok az ısı uygulanırsa, bakteriler boyama sırasında lamı yıkayacaktır.
2. Slayda birincil lekeyi (kristal viyole) uygulamak için bir damlalık kullanın ve 1 dakika bekletin. Fazla lekeyi çıkarmak için slaytı 5 saniyeden uzun olmayan suyla yavaşça yıkayın. Çok uzun süre durulama çok fazla rengi kaldırabilir, ancak yeterince uzun süre durulamama gram negatif hücreler üzerinde çok fazla lekenin kalmasına neden olabilir.
3. Hücre duvarına kristal viyole sabitlemek için slayt Gram iyot uygulamak için bir damlalık kullanın. 1 dakika bekletin.
4. Slaytı yaklaşık 3 saniye boyunca alkol veya asetonla durulayın, ardından hemen su kullanarak hafif bir durulama yapın. Gram negatif hücreler renk kaybederken, gram pozitif hücreler mor veya mavi kalacaktır. Ancak, renk giderici çok uzun süre bırakılırsa, tüm hücreler renk kaybeder!
5. İkincil lekeyi, safranini uygulayın ve 1 dakika bekletin. 5 saniyeden uzun olmayan suyla yavaşça durulayın. Gram negatif hücreler kırmızı veya pembe olarak boyanmalıdır, gram pozitif hücreler hala mor veya mavi görünecektir.
6. Bir bileşik mikroskop kullanarak slayt görüntüle. Hücre şeklini ve düzenini ayırt etmek için 500x ila 1000x'lik bir büyütme gerekebilir.

Gram boyası ile tanımlanan tüm bakteriler hastalıklarla ilişkili değildir, ancak birkaç önemli örnek şunları içerir:

• Gram-pozitif koklar (yuvarlak):Staphylococcus aureus
• Gram-negatif koklar:Neisseria meningitidis
• Gram pozitif basiller (çubuklar): Bacillus anthracis
• Gram-negatif basiller:Escherichia coli