Alanı biyoteknoloji sürekli değişimlerden biridir. En ileri araştırmaların hızlı bir şekilde büyümesi ve gelişmesi, bilim adamları ve potansiyeli temel bir moleküler teknikte görme ve yenisine uygulama yetenekleri süreçler. Polimeraz zincir reaksiyonunun ortaya çıkışı (PCR) genetik araştırmalarda, DNA analizi ve DNA dizilerine göre farklı genlerin tanımlanması. DNA dizilimi de kullanma yeteneğimize bağlıdır jel elektroforezi bir baz çifti kadar büyüklükte farklılık gösteren DNA ipliklerini ayırmak.
DNA dizilimi
1970'lerin sonlarında, daha uzun DNA molekülleri için iki DNA dizileme tekniği icat edildi: Sanger (veya dideoksi) yöntemi ve Maxam-Gilbert (kimyasal bölünme) yöntemi. Maxam-Gilbert yöntemi kimyasallar tarafından nükleotide özgü yarılmaya dayanır ve en iyi oligonükleotitleri (genellikle 50 baz çiftinden daha kısa uzunluktaki küçük nükleotit polimerleri) sıralamak için kullanılır. Sanger yöntemi daha yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü teknik olarak uygulanması daha kolay olduğu kanıtlanmıştır. PCR gelişi ve tekniğin otomasyonu, tüm DNA dahil uzun DNA ipliklerine kolayca uygulanır genler. Bu teknik, PCR uzama reaksiyonları sırasında dideoksinükleotidler tarafından zincir sonlandırılmasına dayanmaktadır.
Sanger Yöntemi
Sanger yönteminde, analiz edilecek DNA ipliği bir şablon olarak kullanılır ve DNA polimeraz, PCR reaksiyonunda, primerler kullanılarak tamamlayıcı iplikler üretmek için kullanılır. Her biri dört nükleotitten (ATP, CTP, GTP veya TTP) birine belirli bir oranda dideoksinükleosid trifosfat (ddNTP) analogları içeren dört farklı PCR reaksiyon karışımı hazırlanır.
Yeni DNA şeridinin sentezi, bu analoglardan biri dahil edilene kadar devam eder, bu sırada iplik erken kesilir. Her PCR reaksiyonu, tümü bu reaksiyon için dideoksi etiketli nükleotit ile biten farklı uzunluklarda DNA iplikçikleri karışımı ihtiva edecektir. Jel elektroforez daha sonra dört reaksiyon şeridini dört ayrı şeritte ayırmak için kullanılır ve orijinal şablonun dizisini, hangi iplik uzunluklarının nükleotit ile bittiği temelinde belirler.
Otomatik Sanger reaksiyonunda, dört farklı renkli floresan etiketle etiketlenmiş primerler kullanılır. PCR reaksiyonları, farklı dideoksinükleotitlerin varlığında, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, daha sonra dört reaksiyon karışımı birleştirilir ve bir jelin tek şeridine uygulanır. Her parçanın rengi bir lazer ışını kullanılarak algılanır ve bilgi bir bilgisayar tarafından toplanır bu, şablon DNA sekansının olabileceği her bir renk için tepe noktaları gösteren kromatogramlar üretir belirlenen.
Tipik olarak, otomatik sekanslama yöntemi sadece maksimum yaklaşık 700-800 baz çiftine kadar olan sekanslar için doğrudur. Bununla birlikte, Primer Walking ve Shotgun sekanslama gibi adım adım yöntemler kullanılarak daha büyük genlerin ve aslında tüm genomların tam sekanslarını elde etmek mümkündür.
Primer Walking'da, daha büyük bir genin uygulanabilir bir kısmı Sanger yöntemi kullanılarak sekanslanır. Sekansın güvenilir bir segmentinden yeni primerler üretilir ve genin orijinal reaksiyonların aralığı dışında kalan kısmını sekanslamaya devam etmek için kullanılır.
Av tüfeği dizilimi, ilgilenilen DNA segmentini rastgele olarak daha uygun bir şekilde kesmeyi gerektirir (yönetilebilir) boyutlu fragmanlar, her bir fragmanı sıralamak ve parçaları üst üste binmeye göre düzenlemek dizileri. Bu teknik, üst üste binen parçaları düzenlemek için bilgisayar yazılımı uygulamasıyla daha kolay hale getirilmiştir.