Biyoteknolojide Protein Saflaştırma Yöntemleri

Biyoteknoloji araştırmasının önemli bir bileşeni, proteinleri tasarlamak veya değiştirmek için protein mühendisliği tekniklerinin kullanılmasıdır. Bu protein saflaştırma teknikleri, spesifik endüstriyel uygulamalar için protein özelliklerini optimize eder.

Bu teknikler bilim insanlarının ilgili proteinleri izole etmelerini ve saflaştırmasını gerektirir, böylece uyumları ve substrat spesifisiteleri araştırılabilir. Ayrıca, diğer ligandlarla (bir reseptör proteinine bağlanan bir protein) ve spesifik enzim aktiviteleriyle reaksiyonlar da gerektirir.

Gereken protein saflığının derecesi, proteinin amaçlanan nihai kullanımına bağlıdır. Bazı uygulamalar için ham bir özüt yeterlidir. Gıdalar ve farmasötikler gibi diğer kullanımlar yüksek düzeyde saflık gerektirir. İçin çeşitli teknikler protein saflaştırma istenen saflık seviyesine ulaşmak için kullanılır.

Her protein saflaştırma adımı genellikle bir dereceye kadar ürün kaybıyla sonuçlanır. Bu nedenle, ideal bir protein saflaştırma stratejisi, en az aşamada en yüksek saflaştırmaya ulaşılan stratejidir.

Hangi adımların kullanılacağı seçimi, hedef proteinin boyutuna, yüküne, çözünürlüğüne ve diğer özelliklerine bağlıdır. Aşağıdaki teknikler, tek bir sitosolik proteinin saflaştırılması için en uygun olanlardır.

Sitosolik protein komplekslerinin saflaştırılması daha karmaşıktır ve genellikle farklı yöntemlerin uygulanmasını gerektirir.

Hücre içi (hücre içinde) proteinleri saflaştırmanın ilk adımı, ham bir ekstraktın hazırlanmasıdır. Ekstrakt, hücre sitoplazmasından ve bazı ek makromoleküllerden, kofaktörlerden ve besinlerden gelen tüm proteinlerin karmaşık bir karışımını içerecektir.

Bu ham ekstrakt biyoteknolojideki bazı uygulamalar için kullanılabilir. Bununla birlikte, saflık bir sorunsa, sonraki saflaştırma adımlarının izlenmesi gerekir. Ham protein özleri, kimyasallar kullanılarak elde edilen hücre lizizi ile üretilen hücresel döküntülerin çıkarılmasıyla hazırlanır, enzimler, seslendirme veya Fransız Basını.

Kalıntı santrifüjleme ile çıkarılır ve süpernatan (katı bir tortunun üzerindeki sıvı) geri kazanılır. Hücre dışı (hücre dışında) proteinlerin ham preparatları, hücrelerin santrifüj leme yoluyla çıkarılmasıyla elde edilebilir.

Kesin olarak biyoteknoloji ısıya dayanıklı enzimlere talep vardır - yüksek spesifik aktiviteyi sürdürürken, denatüre etmeden yüksek sıcaklıklara tolere edebilen enzimler.

Isıya dayanıklı proteinler üreten organizmalara bazen ekstremofil denir. Isıya dayanıklı bir proteinin saflaştırılmasına kolay bir yaklaşım, karışımdaki diğer proteinleri çözelti ısıtılır, daha sonra çözelti soğutulur (böylece termostabil enzimin, gerekli). Denatüre proteinler daha sonra santrifüj ile uzaklaştırılabilir.

Modern biyoteknoloji protokoller genellikle standart prosedürler için hazır çözümler sağlayan piyasada bulunan birçok kit veya yöntemden yararlanır. Protein saflaştırması genellikle filtreler ve hazırlanmış jel filtrasyon kolonları kullanılarak yapılır.

Diyaliz kitinin talimatlarını izleyin ve doğru çözeltinin doğru hacmini ekleyin ve yeni bir testte yıkama sıvısı (kolondan geçen çözücü) toplanırken belirtilen süre tüp.

Kromatografik yöntemler tezgah üstü kolonlar veya otomatik HPLC ekipmanı kullanılarak uygulanabilir. HPLC ile ayırma, ters faz, iyon değiştirme veya boyut dışlama yöntemleri ve diyot dizisi veya lazer teknolojisi ile tespit edilen örnekler ile yapılabilir.

Geçmişte, bir proteini ham bir ekstrakttan saflaştırmanın ortak bir ikinci adımı, yüksek ozmotik mukavemete sahip bir çözelti (yani tuz çözeltileri) ile çökeltilmektir. Protein çökeltme genellikle tuz olarak amonyum sülfat kullanılarak yapılır. Ham ekstrakttaki nükleik asitler, streptomisin sülfat veya protamin sülfat ile oluşturulan çökeltilerin çökeltilmesiyle giderilebilir.

Tuz çökeltmesi genellikle yüksek oranda saflaştırılmış bir proteine ​​yol açmaz, ancak bir karışımdaki bazı istenmeyen proteinleri ortadan kaldırmaya ve numuneyi konsantre etmeye yardımcı olabilir. Çözeltideki tuzlar daha sonra gözenekli selüloz tüpü, filtrasyon veya jel dışlama kromatografisi yoluyla diyaliz yoluyla uzaklaştırılır.

Farklı proteinler, farklı amonyum sülfat konsantrasyonlarında çökelecektir. Genel olarak, daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinler, düşük amonyum sülfat konsantrasyonlarında çökelir.

Ters faz kromatografisi (RPC) proteinleri nispi hidrofobikliklerine (polar olmayan moleküllerin sudan hariç tutulması) göre ayırır. Bu teknik oldukça seçicidir, ancak organik çözücülerin kullanılmasını gerektirir.

Bazı proteinler çözücüler tarafından kalıcı olarak denatüre edilir ve RPC sırasında işlevselliği kaybeder. Bu nedenle, özellikle hedef proteinin aktiviteyi sürdürmesi gerekiyorsa, bu yöntem tüm uygulamalar için önerilmez.

İyon değişim kromatografisi, proteinlerin yüke göre ayrılmasını ifade eder. Kolonlar anyon değişimi veya katyon değişimi için hazırlanabilir. Anyon değişim kolonları, negatif yüklü proteinleri çeken pozitif yüklü bir sabit faz içerir.

Katyon değiştirme kolonları, pozitif yüklü proteinleri çeken ters, negatif yüklü boncuklardır. Hedef protein (ler) in elüsyonu (bir materyalin bir diğerinden çıkarılması) pH değeri değiştirilerek yapılır. her birinin yüklü fonksiyonel gruplarında değişiklik veya nötralizasyon ile sonuçlanan sütun protein.

Boyut dışlama kromatografisi (jel filtrasyonu olarak da bilinir), daha büyük proteinleri daha küçük proteinlerden ayırır. çünkü daha büyük moleküller kromatografideki çapraz bağlı polimerden daha hızlı geçerler sütunu. Büyük proteinler polimerin gözeneklerine uymazken, daha küçük proteinler daha az doğrudan bir yolla kromatografi kolonundan geçerek daha uzun sürebilir.

Eluat (elüsyon sonucu), elüsyon süresine bağlı olarak proteinleri ayıran bir dizi tüpte toplanır. Jel filtrasyon, hedef proteini başlangıçta kolona eklenmiş olandan daha küçük bir elüsyon hacminde toplandığından, bir protein örneğini konsantre etmek için yararlı bir araçtır. Benzer filtreleme teknikleri, maliyet etkinliği nedeniyle büyük ölçekli protein üretimi sırasında kullanılabilir.

Afinite kromatografisi, protein saflaştırma işleminin "parlatılması" veya tamamlanması için çok yararlı bir tekniktir. Kromatografi kolonundaki boncuklar, spesifik olarak hedef proteine ​​bağlanan ligandlara çapraz bağlanır.

Protein daha sonra serbest ligandlar içeren bir çözelti ile durulanarak kolondan çıkarılır. Bu yöntem, diğer tekniklere kıyasla en saf sonuçları ve en yüksek spesifik aktiviteyi verir.

SDS-PAGE (poliakrilamid jel elektroforezi ile kullanılan sodyum dodesil sülfat) proteinlere bağlanır ve onlara büyük bir net negatif yük verir. Tüm proteinlerin yükleri oldukça eşit olduğundan, bu yöntem onları neredeyse tamamen boyuta göre ayırır.

SDS-PAGE genellikle bir serinin her adımından sonra proteinin saflığını test etmek için kullanılır. İstenmeyen proteinler yavaş yavaş karışımdan uzaklaştırıldığından, SDS-PAGE jeli üzerinde görüntülenen bant sayısı, istenen proteini temsil eden sadece bir bant olana kadar azalır.

İmmünoblotlama, afinite kromatografisi ile kombinasyon halinde uygulanan bir protein görselleştirme tekniğidir. Spesifik bir protein için antikorlar, bir afinite kromatografisi kolonunda ligandlar olarak kullanılır.

Hedef protein kolon üzerinde tutulur, daha sonra kolon bir tuz çözeltisi veya başka ajanlarla durulanır. Radyoaktif veya boya etiketlerine bağlı antikorlar, karışımın geri kalanından ayrıldıktan sonra hedef proteinin saptanmasına yardımcı olur.